فرمت فایل : WORD (قابل ویرایش)
تعداد صفحات:117
عنوان : تکامل سلولهای جرم مرحله میوتیک و پست میوتیک در طی کشت سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی انسانی بر روی لایه تغذیه کننده و حضور غلظت های مختلف رتینوئیک اسید وBMP4
پایان‌نامه برای دریافت درجه‌ی کارشناسی ارشد
در رشته‌ی زیست شناسی گرایش فیزیولوژی جانوری
فهرست مطالب:
تشکر و قدردانی:
چکیده:
1-1مقدمه
1-2- ویژگی های کلی سلول های بنیادی
1-2-1- تقسیم بندی سلول های بنیادی
1-2-1-1- سلولهای بنیادی جنینی ESc))
1-2-1-2- سلولها بنیادی زایا EGc) )
1-2-1-3- سلولهای کارسینومای جنینیECc) )
1-2- 1-4 سلولهای بنیادی زایای چند توان mGCs) )
1-3-منشا سلولهای زایای ابتدایی (PGC) و چرخه تکامل آنها در محیط داخل بدن
1-4-فاکتورهای لازم برای اختصاصی شدن در مراحل مختلف مهاجرت و تکامل
1-5 - مراحل تبدیل PGC ها به اسپرماتوگونی
1-6- انواع اسپرماتوگونی استم سلها در انسان و موش
1-7- مرحله تمایز در توسعه اسپرماتوگونی ها
1-8- نقش سلولهای سرتولی در تکثیر وتمایز اسپرماتو گونی ها
1-9- تعریف ناباروری، انواع آزواسپرمی و آناتومی بیضه در افراد نابارور
1-10- نقش بوسولفان در تولید بیضه آزواسپرم
1-۱۱- افراد سرطانی و مورفولوژی بیضه آنها
1-12- معرفی پروتئین ریخت زای استخوان و انواع کلاس آن ها
1-12-1 مطالعات انجام گرفته بر روی پروتئین BMP4
1-12-2- مسیر سیگنالی پروتئین ریخت زای استخوان
1- 13- نقش رتینوئیک اسید در تکثیر وتمایز جرم سلها
1-13-1 مسیر سیگنالی رتینوئیک اسید
1-13-2- نقش ژن stera-8 در شروع میوز در پستانداران
1-1۴- ژنهای بیان شده در مراحل مختلف اسپرماتوژنز و نشانگرهای سطحی سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی
۱-1۵- استفاده از محیط کشتهای مختلف برای تکثیر وتمایز سلولهای اسپرماتوگونی
1-16- نانو فایبر و انواع آن
1-16-1 ساخت داربست ها به روش الکتروریسی (Electrospining)
1-16-2 استفاده از نانو فایبر در کشت سلولهای بنیادی
۱-17- پیشینه پژوهش
1-18-اهداف کلی
1-19- اهداف ویژه
1-20-اهداف کاربردی
1-21- فرضیات پژوهش
2-1- دستگاه ها و مواد مورد استفاده
1-1مقدمه
1-2- ویژگی های کلی سلول های بنیادی
1-2-1- تقسیم بندی سلول های بنیادی
1-2-1-1- سلولهای بنیادی جنینی ESc))
1-2-1-2- سلولها بنیادی زایا EGc) )
1-2-1-3- سلولهای کارسینومای جنینیECc) )
1-2- 1-4 سلولهای بنیادی زایای چند توان mGCs) )
1-3-منشا سلولهای زایای ابتدایی (PGC) و چرخه تکامل آنها در محیط داخل بدن
1-4-فاکتورهای لازم برای اختصاصی شدن در مراحل مختلف مهاجرت و تکامل
1-5 - مراحل تبدیل PGC ها به اسپرماتوگونی
1-6- انواع اسپرماتوگونی استم سلها در انسان و موش
1-7- مرحله تمایز در توسعه اسپرماتوگونی ها
1-8- نقش سلولهای سرتولی در تکثیر وتمایز اسپرماتو گونی ها
1-9- تعریف ناباروری، انواع آزواسپرمی و آناتومی بیضه در افراد نابارور
1-10- نقش بوسولفان در تولید بیضه آزواسپرم
1-۱۱- افراد سرطانی و مورفولوژی بیضه آنها
1-12- معرفی پروتئین ریخت زای استخوان و انواع کلاس آن ها
1-12-1 مطالعات انجام گرفته بر روی پروتئین BMP4
1-12-2- مسیر سیگنالی پروتئین ریخت زای استخوان
1- 13- نقش رتینوئیک اسید در تکثیر وتمایز جرم سلها
1-13-1 مسیر سیگنالی رتینوئیک اسید
1-13-2- نقش ژن stera-8 در شروع میوز در پستانداران
1-1۴- ژنهای بیان شده در مراحل مختلف اسپرماتوژنز و نشانگرهای سطحی سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی
۱-1۵- استفاده از محیط کشتهای مختلف برای تکثیر وتمایز سلولهای اسپرماتوگونی
1-16- نانو فایبر و انواع آن
1-16-1 ساخت داربست ها به روش الکتروریسی (Electrospining)
1-16-2 استفاده از نانو فایبر در کشت سلولهای بنیادی
۱-17- پیشینه پژوهش
1-18-اهداف کلی
1-19- اهداف ویژه
1-20-اهداف کاربردی
1-21- فرضیات پژوهش
2-1- دستگاه ها و مواد مورد استفاده
2-1- محلول های مورد استفاده جهت کشت سلول های بنیادی اسپرماتوگونی
2-1-۲ آنزیمهای استفاده شده برای هضم آنزیمی
2-2 –استفاده از پروتئین BMP4 در طی کشت
2-3- تهیه محلول استوک رتینوئیک اسید (01/0 مولار)
2-4- آنتی‌بیوتیک‌ها
2-5- تهیه‌ی تریپان بلو
2-6 - روش آماده سازی FBS
2-7- محلول استوک EDTA (5/0 مولار)
2-8- مراحل آماده سازی نانو فایبر PLLA
2-8- مراحل جداسازی سلول های بنیادی اسپرماتوگونی جهت کشت
2-8-1مرحله اول هضم آنزیمی
2-8-2- مرحله دوم هضم آنزیمی
2-8-3 شمارش سلول ها با تریپان بلو
2-8-5 پاساژ دادن سلول ها
2-8-6 ارزیابی کلنی زایی در سلولهای اسپرماتوگونی
2-9- بررسی بیان ژنها به روش PCR
2-9-1-مراحل انجام PCR
2-9-1-1- استخراج RNA
2-9-1-2- تعیین غلظت RNA استخراج شده
2-9-1-3-حذف آلودگی DNA از RNA
2-9-1-4- سنتز cDNA از روی RNA استخراج شده
2-9-1-5- واکنش PCR
2-9-1-6- آماده سازی پرایمرها
2-9-1 -7- الکتروفورز ژل آگارز
2-9-1-8- روش تهیه بافر TEA/1X
2-9-1-9-روش تهیه ژل آگارز
2-10- پروتکل ایمونوهیستوشیمی:
3- 1- نتایج حاصل از استخراج سلول های اسپرماتوگونی و سلولهای سرتولی طی دو مرحله هضم آنزیمی
3-2- بررسی درصد حیات (زنده ماندن) سلولها پس از استخراج
3-3- نتایج حاصل از انجام واکنش ایمونوسیتوشیمی برای تائید ماهیت سلول های سرتولی
3-4- نتایج حاصل از کشت اولیه سلول های بنیادی اسپرماتوگونی بر روی لایه غذا رسان سرتولی در گروه های مختلف
3-5- بررسی مورفولوژی کلنی های تشکیل شده در هفته اول پس از کشت در گروههای مختلف
3-6- بررسی مورفولوژی کلنی های بدست آمده از کشت در گروه کنترل در پایان هفته دوم و سوم
3-7- نتایج حاصل از تمایز سلول های بنیادی اسپرماتوگونی بر روی نانو فایبر PLLA
3-8- نتایج حاصل از تمایز سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی پس از افزودن دوز ng/ml 5 BMP4 از لحاظ مورفولوژی
3-9- نتایج حاصل از تمایز سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی پس از افزودن دوز ng/ml BMP4 5/0
3-10- نتایج حاصل از تمایز سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی همراه افزودن دوز ng/ml 6-10 رتینوئیک اسید
3-11- نتایج حاصل از تمایز سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی پس از افزودن دوز ng/ml 5-10 رتینوئیک اسید
3-12-مقایسه تعداد کلونی ها در گروه کنترل و گروههای آزمایش طی گذشت سه هفته از کشت
3-13-مقایسه قطر کلونی ها در گروه کنترل و گروههای آزمایش طی گذشت سه هفته از کشت
3-14- نتایج حاصل از استخراج RNA از سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی
3-15- نتایج حاصل از سنتز cDNA از RNA استخراج شده
3-16-نتایج حاصل از بار گذاری محصولات PCR برای ژنهای SCP3، ACR، PLZF در گروه کنترل
3-17- نتایج حاصل از استخراج و بار گذاری PCR در گروه های مختلف تمایزی و بررسی بیان آنها بر روی ژل آگارز
بحث و نتیجه گیری
پیشنهادات
Refferencess:
چکیده:
بر طبق آمارهای جهانی سال 2003 امروزه در دنیا بالغ بر 5-15 درصد از زوجهای جوان نابارور هستند حفظ ونگهداری
SSC و القای اسپرماتوژنز در شرایط in vitro میتواند به عنوان یک استراتژی درمانی برای درمان ناباروری در مردانی باشد که در معرض شیمی درمانی یا اشعه درمانی بوده ویا ضایعات نخاعی امکان ورورد به فاز میوز را در آنها مختل کرده است. در این
مطالعه ابتدا بیوپسی بیضه بیماران آزواسپرمی مورد دو مرحله هضم آنزیمی قرار گرفت. سپس سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی
جدا شده و درحضور و عدم حضور لایه سرتولی و نیز اضافه کردن دوزهای مختلف رتینوئیک اسید (غلظتهای ng/ml 5-10 و ng/ml 6-10RA) و دوزهای مختلف BMP4 ( غلظت های 5ng/ml و BMP4 ./5ng/ml ) قرار گرفتند. پس از3 هفته از کشت اثرات سرتولی سل و PLLA روی تمایز کلونیهای SSC به وسیله مشاهدات میکروسکوپی ونیز بیان ترانس کریپت پیش میوزی PLZF , میوزی SCP3 و پست میوزی ACR با استفاده از RT-PCRمورد بررسی قرار گرفت . نتایج نشان داد سوسپانسیون سلولی عمدتا شامل دو نوع سلول بود: پس از گذشت 72 ساعت از کشت سلولهای نسبتا کوچک و دانه دار سرتولی یک لایه سلولی ایجاد کردند ولی سلولهای اسپرماتوگونی که دارای یک هسته بزرگ و دو یا چند هستک خارج از مرکز بودند به صورت معلق باقی ماندند. تعداد و قطر کلنی ها در گروههای آزمایشی مختلف به مدت سه هفته با استفاده از میکروسکوپ invert (فاز کنتراست ) مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد کلنی های بدست آمده در تمام گروه ها از لحاظ ظاهری دو نوع بودند: دسته اول کلنی هایی که از نظر اندازه بزرگ تر از کلنی های نوع دو بوده و ظاهری برجسته و گرد داشتند. این کلنی ها بیشتر شبیه به کلنی های سلولهای بنیادی جنینی ES)) به نظر می رسیدند. دسته دوم کلنی ها از نظر اندازه کوچکتر بوده و حالت کشیده و گسترده ای داشتند. این کلنی ها به عنوان کلنی های سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی در نظر گرفته شده و شمارش شدند. با افزایش هفته های کشت در همه گروههای کشتی بر تعداد کلونی ها افزوده شد. به طوریکه در هردو دوز BMP4 ( غلظت های ۰.۵ و ۵ نانوگرم بر میلی لیتر) و نیز هر دو دوز RA ( غلظت های 5-10 و ۶- ۱۰ نانوگرم بر میلی ایتر) در هفته سوم کشت اختلاف معنی دار نسبت به هفته اول مشاهده می شود (P ≤ 0.05). افزایش تعداد کلونی ها در این دوزها نسبت به گروه کنترل در هفته سوم کشت معنی دار است P ≤ 0.05)).
بیشترین تعداد کلونی ها در گروه کشت سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی بر روی لایه تغذیه کننده سرتولی و حضور غلظت ۵
نانوگرم BMP4مشاهده می شود. کمترین تعداد کلونی ها در گروه کنترل مشاهده می شود. از بین دو دوز RA ( غلظت های 5-10 و ۶- ۱۰ نانوگرم بر میلی ایتر) دوز ۶- ۱۰نانوگرم تاثیر بیشتری در افزایش تعداد کلونی ها دارد. با افزایش هفته های کشت بر قطر کلونی ها نیز افزوده شد. به طوریکه در هردو دوز BMP4 ( غلظت های ۰.۵ و ۵ نانوگرم بر میلی لیتر) و نیز هر دو دوز RA ( غلظت های5-10 و ۶- ۱۰ نانوگرم بر میلی ایتر) در هفته سوم کشت اختلاف معنی دار نسبت به هفته اول مشاهده می‌شود (P ≤ 0.05). بیشترین قطر کلونی ها در گروه کشت سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی بر روی لایه تغذیه کننده سرتولی و حضور
غلظت ۵ نانوگرم BMP4مشاهده می شود. کمترین قطر کلونی ها در گروه کنترل مشاهده می شود. ازبین دو دوز رتینوییک اسید دوز
5-10 تاثیر بیشتری در افزایش قطر کلونی ها دارد.
بیان هیچ یک از مارکر های میوزی و پس میوزی در گروه کنترل که از هیچ فاکتور تمایزی استفاده نکرده بود دیده نشد . بیان ژن SCP3 در گروه القا شده با دزng/ml 6-10 رتینوئیک اسید به وضوح قابل مشاهده می باشد و نشان می دهد که سلول های بنیادی اسپرماتوگونی وارد فاز پس میوزی شده اند. بیان ژن SCP3 در گروه سلولهای بنیادی القا شده توسط دوز 5 نانوگرم BMP4 در روز 21 کشت مشهود بود ولی نسبت به بیان این ژن در گروه القا شده با دوز های رتینوئیک اسید میزان بیان کمتری را نشان می داد .
نتایج حاصله حاکی از آن بود که سلولهای بنیادی اسپرماتوگونیا در سیستم کشتی طراحی شده در این تحقیق دارای خاصیت خودنوزایی بودند. با بهبود شرایط کشت، امکان تکثیر و تمایز سلولهای بنیادی اسپرماتوگونیای انسانی بر روی سلولهای سرتولی پس از جداسازی از بیضه امکان پذیر است. ساختار این سلولها در محیط کشت از لحاظ مورفولوژیکی دچار تغییر نمی گردد
کلید واژه‌ها : سلول¬های بنیادی اسپرماتوگونی ، آزواسپرمی ، رتینوئیک اسید، BMP4، PLLA
پایان نامه تکامل سلولهای جرم مرحله میوتیک و پست میوتیک در طی کشت سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی انسانی
