اختصاصی از
سورنا فایل دانلود مقاله ایمن سازی دهانی با ذرات نانو پادگن-جفتی دانلود با لینک مستقیم و پر سرعت .
چکیده
عوامل بیماری زای ناشی از غذا یا آب میزبان خود را از طریق سطوح مخاطی روده ای مورد هجوم قرار می دهند، و بنابراین واکس های دهانی مؤثر تا حد زیادی بیماریهای مسری را کاهش میدهند. ماهیت پادگن و همچنین حالت درونی سازی آن در مخاط روده ای بر روی واکنش های ایمنی تأثیر می گذارد. ما نشان میدهیم که اوالبومین پادگن پروتئین مدل (Ova) از طریق دهان (p.o.) تحمل دهانی (OT) را تحریک میکند که توسط واکنش پادتن بدنی lgG1 توصیف می گردد، که نمی توان آنرا توسط ایمن سازی زیرپوستی (s.c.) با Ova با دوای ممد فروند (CFA) تقویت کرد. lgA روده ای تولید شده در واکنش نسبت به تغذبه Ova با گذشت زمان کاهش پیدا کرد و توسط مدیریت Ova ترکیب شده با 20 nm از ذرات نانو (NP-Ova) تغییر داده شد. مدیریت p.o. از IgG1/IgG2c بدنی Ova-NP و مخاط روده ای برای تراوش IgA را تحریک میکرد. این واکنش ها توسط ایمن سازی s.c. با ایمن سازی p.o. یا Ova+CFA همراه با Ova-NP تقویت می شدند. البته فقط در سرم موش های تقویت شده توسط s.c. و پادتن های مخاطی چگالی محلول ها پس از آماده سازی بمدت 6 ماه در اندازه بالا باقی ماندند. برعکس، آماده سازی s.c. با Ova-NP پادتن های سرم با سلطه IgG1 را تحریک می کرد، اما مخاط روده ای را برای تراوش IgA ، حتی پس از ایمن سازی ثانوی p.o. با Ova-NP آماده نمی کرد. این نتایج نشان میدهند که Ova ترکیب شده با NP ها به شکل ایمن زا به محیط درمانی داخلی می رسد، و اینکه ایمن سازی مخاطی با Ova-NP برای القاء واکنش ایمنی Th1/Th2 قطبیده و همچنین واکنش IgA روده ای ضروری است. همچنین، آماده سازی مخاطی با Ova-NP همراه با تقویت s.c.واکنش های حافظه مخاطی و بدنی را تحریک میکند. این یافته ها برای ساخت واکسن های مخاطی موثر مهم هستند.
مقدمه
اغلب عفونت های انگلی، ویروسی و باکتریایی در سطوح مخاطی رخ میدهند و بنابراین ساخت واکسن های مخاطی مؤثر تا حد زیادی بیماریهای عفونتی و مسری را کاهش میدهد. البته این کار عمدتاً بخاطر ثبات ضعیف، بالاگیری، و ایمن زایی پادگن های مخاطی مشکل است. در نتیجه، واکسن های مخاطی خیلی کمی در حال حاضر برای استفاده در انسان ها مجاز می باشند. واکسن های دهانی خصوصاً برای ایمن سازی گسرتده راحت هستند، چون آنها در تزریقات پراگوارشی ترجیح داده می شوند و استفاده از آمپول و سرنگ را حذف میکنند. واکسن های دهانی برای اینکه مؤثر باشند باید بطور مؤثر در سطوح مخاطی دورنی گردند و عامل تأثیرگذار مختص به پادگن، و همچنین واکنش سلول های B و T را تحریک کند. پادگن های مخاطی خصوصاً برای محافظت در مقابل عوامل بیماریزا و زهرابه های آنها مهم هستند، که می تواند پادگن های مخاطی را خنثی سازد و دسترسی آنها به محیط درمانی داخلی را محدود سازد. IgA تراوشی می تواند میکرو ارگانیسم ها و زهرابه ها را خنثی سازد و از تماس آنها با مانع سلولی مخاطی جلوگیری کند. خصوصاً مشخص شد که IgA روده ای سم وبا را خنثی می سازد و جنبدگی سالمونلا را کاهش میدهد و همچنین توانایی باسیل شیگلا برای هجوم بر بافت پوششی روده ای را کاهش میدهد. همچنین، مشخص شد که انتقال دهانی پادگن های IgA خاص از موش ها در مقابل عفونت های باکتریایی مانند ، ، و حفاظت میکنند. IgA علاوه بر کمک به به دام انداختن پادگن ها در مخاط روده ای، برای بیرون انداختن پادگن ها از محیط درمانی داخلی در لومن روده ای از طریق ترانسیتوسیز، و همچنین انتقال پادگن های لومن به بافت های خلطی زیرین برای آغاز واکنش های ایمنی نیز مهم است. اگرچه واکسیناسیون پراگوارشی پادگن های بدنی و حفاظت در مقابل بعضی از عوامل بیماریزای مخاطی مانند HPV، ویروس های فلج اطفال و آنفولانزا را تحریک میکند، و واکسیناسیون مخاطی پادتن های بدنی و مخاطی موضعی را تحریک میکند که حفاظت در مقابل عوامل بیماریزای مخاطی مانند HIV، روتاویروس، نورو ویروس، و را ایجاد میکنند. بنابراین، تأثیر و کارایی یک واکسن دهانی تا حد زیادی به توانایی واکسن برای تحریک تولید بلند مدت پادتن ها در سطوح مخاطی بستگی دارد. همچنین، برای افزایش کارایی فرمول بندی واکنش، استراتژی های ایمن سازی مختلفی مورد استفاده قرار می گیرند. سیستم ایمن سازی تقویت-اصلی بر روی موضعی سازی و قدرت واکنش ایمنی، و در نتیجه بر روی کارایی واکسن تأثیر می گذارد. ایمن زایی بسیاری از فرمول بندی های واکسن ها به مدیریت همزمان آنها با دوای ممد بستگی دارد. البته نگرانی های امنیتی در مورد استفاده از دواهای ممد وجود دارد. همچنین، کاهش زهراگینی واکسن های زنده که برای ایمن سازی مخاطی ایجاد می گردد، نگرانی هایی را پیش می آورد که آسیب های تقلیل داده شده ممکن است باعث برگشت، راه اندازی، یا تشدید بیماری های خود ایمن گردند، و یا باعث بیماری هایی در افراد ایمن-سازگار شده شود.
برای غلبه بر بعضی از این مشکلات، استفاده از ذرات در مقیاس نانو بعنوان ابزاری برای استفاده همراه با پادگن ها یا داروها متداول شده است. NP هایی با اندازه های مختلف از موادی با زیست تجزیه پذیر ساخته شده اند می توان آنها را با پادگن های بسیاری ترکیب کرد، و بنابراین بصورت بالقوه ایمن هستند و در عین حال ایمنی در مقابل عوامل بیماریزای بسیاری را تحریک میکنند. NP های بزرگتر از 200 نانومتر بعلت توانایی خود برای حمل مقدار زیادی از پادگن، عمدتاً همراه با پادگن ها استفاده می گردند. البته NP های کوچک تر نیز می توانند به مانع مخاطی نفوذ کنند و در سطوح مخاطی بصورت موثرتری در مقایسه با NP های بزرگتر، درونی سازی گردند. ما نشان دادیم که سلول های مخاطی روده ای p.o. همراه با NP های 20 و 40 نانومتری را درونی می سازند، که سپس به گره های لنفاوی میان روده ای (MLN) انتقال داده می شوند. ما در اینجا اثبات میکنیم که پادگن ترکیب شده با NP ، p.o. هایی را مدیریت میکند که به شکل ایمن زا به محیط درمانی داخلی می رسند و پادگن های بدنی و مخاطی را تحریک میکنند. ما همچنین نشان میدهیم که آماده سازی مخاطی با Ova-NP برای یک واکنش ایمنی Th1/Th2 بدنی ترکیبی ضروری است. بعلاوه، آماده سازی مخاطی با Ova-NP همراه با ایمن سازی تقویت s.c. برای تحریک سرم های بلند مدت IgG1 و IgG2c و همچنین IgA روده ای ضروری بود. این یافته ها مفاهیمی برای ساخت واکسن های مخاطی و استراتژی های ایمن سازی تقویت-اصلی دارند. این مطالعه همچنین به درک مکانیزم های اساسی کمک میکند که بر واکنش های ایمنی برای پادگن های دهانی غالب هستند.
مواد و روشها
بیانیه اخلاقی
این مطالعه در تطابق شدید با پیشنهادات راهنمای مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی از سازمان های ملی بهداشت انجام شد. این پروتکل توسط هیئت مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه جنوبی ایلی نویز اثبات شد. حیوانات توسط تسهیلات آموزشی، فنی و پرسنل دامپزشکی نگهداری می شدند.
حیوانات، واکنشگرها و پادتن ها
برای این مطالعات، از موش های نر و ماده C57BL/6 با سن 6 تا 8 هفته استفاده شد. Chicken Ova بعنوان پادگن پروتئین مد استفاده شد. ذرات نانوی پلی استیرن فلورسنت با تغییر اسید کربوکسیلیک با Ova ترکیب شد و هر دسته ای از NP های جفتی توسط نقطه-لکه تحلیل شد. پادتن های ضد Ova خرگوش در ترکیب با streptavidin-FITC برای شناسایی Ova و Ova-NP بعنوان لکه های نقطه ای استفاده شد. پادتن های IgA ، IgG1 و IgG2c ضد موش از بز ترکیب شده با فسفاتاز قلیایی برای تعیین چگالی محلول پادتن در عصاره های سرم و سرگینی از موش های ایمن شده استفاده می شدند.
مدیرین Ova و Ova-NP در موش ها
برای ایمن سازی های p.o. موش ها بمدت 4 ساعت گرسنه نگه داشته شدند، و سپس (کنترل)، و یا دوز معادل با Ova با استفاده از یک آمپول در روزهای 0، 3، 6 و 8 از طریق شکم به بدن آنها وارد شد. بطور کلی، موش ها (کنترل)، ، و (بصورت Ova-NP یا محلول Ova) دریافت کردند. برای ایمن سازی، NP ها تا تقلیل داده شدند. در آزمایشات دیگر، موش ها توسط p.o. با Ova-NP یا s.c. با از Ova-NP ، و سپس p.o. تقویت شده با از Ova-NP رقیق شده در PBS تا 10 درصد نسبت به غلظت اولیه خود به اندازه 2 درصد آماده سازی شدند.
جمع آوری قرص های مدفوعی و نمونه های خون
قبل از ایمن سازی و هر هفته پس از آن، قرص های مدفوعی از هر موش جمع آوری شد و در PBS حاوی 0.02 درصد آزید سدیم تا غلظت نهایی 100 میلی گرم ماده خشک/میلی لیتر از PBS رقیق شد. قرص های مدفوعی رقیق شده همگن شدند و سپس بمدت 10 دقیقه در معرض نیروی گریز از مرکز g × 10000 قرار داده شدند. شناور خالی از باقیمانده های مدفوعی جمع آوری شدند و در دمای -20 درجه سانتیگراد تا زمان تحلیل بعدی ذخیره شدند. نمونه های خون از طریق رگ دم با استفاده از یک سوزن 30 g جمع آوری شدند، و سرم در دمای -20 درجه سانتیگراد تا زمان تحلیل بعدی ذخیره شد.
تعیین چگالی محلول پادتن مختص به Ova در عصاره های سرم و مدفوعی با استفاده از معیار ELISA
صفحات 96 حفره ای با ته پهن با از محلول Ova در بافر پوشش دهی روکش کاری شدند و در طول شب در دمای 4 درجه سانتیگراد نگه داشته شدند. پس از اینکه پادگن رها شده برداشته شد، حفره ها بمدت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد با از بافر انسداد مسدود شدند. اگرچه آلبومین سرم گاوی (BSA) اغلب برای معیارهای ELISA استفاده می گردد، با اینحاب برای اجتناب از خطاهای آزمایشی ناشی از واکنش های بین BSA و پادتن های مختص به Ova و همچنین واکنش های بین Ova و پادتن های شد BSA، از ژلاتین خوکی استفاده شد. پس از انسداد، صفحات سه بار با PBS حاوی 0.05 درصد Tween-20 و 0.02 درصد آزید سدیم با استفاده از یک شوینده اتوماتیک شسته شدند. پس از شستشو، از نمونه به ستون اول حفره ها اضافه شد و سپس در حفره های متوالی بافر انسداد رقیق شد و در طول شب در دمای 4 درجه سانتیگراد پرورانده شدند. سپس صفحات سه بار شسته شدند و سپس به هر حفره از IgG1 ، IgG2c یا IgA ضد موش از بز ترکیب شده با APاضافه شد، که به اندازه رقیق شدند و در بافر انسداد قرار داده شدند و بمدت 2 ساعت در دمای اتاق پرورانده شدند. سپس صفحات سه بار شسته شدند و فعالیت AP توسط اضافه سازی از زیرلایه AP آزمایش شد و سپس بمدت 20 دقیقه در دمای اتاق و به دور از نور پرورانده شدند. سپس واکنش با متوقف شد و مقدار جذب در 405 نانومتر با استفاده از یک صفحه خوان خوانده شد. چگالی های محلول پادتن بصورت مقدار از بالاترین رقیق سازی متقابل بیان می گردند که مقدار OD به اندازه دو برابر کنترل منفی بدست می آید.
تحلیل آماری
هر آزمایش دوبار تکرار شد. داده ها با استفاده از راهکارهای ANOVA از نرم افزار SAS تحلیل شدند. میانگین گروه ها با استفاده از آزمایش Student’s t-test یا راهکار مقایسه چندگانه Tukey جداسازی شدند و بصورت خیلی متفاوت با در نظر گرفته شدند. داده ها بصورت میانگین انحراف استاندارد بیان شدند.
نتایج
مدیریت p.o. از Ova-NP سرم IgG2c/IgG1 و IgA روده ای را تحریک میکند، درحالیکه تغذیه Ova سرم پادتن های IgG1-غالب و IgA روده ای کوتاه مدت را تحریک میکند
ما بررسی کردیم که آیا مدیریت Ova ترکیب شده با p.o. های NP (و نه OT) ایمنی مختص به پادتن ها را تحریک میکند. OT یک پادتن خوراکی را ایجاد میکند که توسط کاهش در عملکردهای سلول T، متوقف سازی سرم IgE، IgG2a وابسته به Th1، و همچنین واکنش های IgA مخاطی توصیف شده است. بنابراین ما برای کنترل پروتکل ایمن سازی ، دوز بالایی از Ova برای کاهش OT را استفاده کردیم تا بررسی کنیم که آیا تحویل Ova از طریق NP ها OT را لغو میکند یا نه. همچنین، گروهی از موش ها با دوز پایینی از Ova محلول تغذیه شدند تا این امکان از بین برود که واکنش های ایمنی مشاهده شده در موش های ایمن شده Ova-NP بعلت دوز پادگن هستند. یک ویژگی دیگر OT متوقف سازی واکنش بدنی و همچنین واکنش ایمنی روده ای نسبت به نمایش پادگن بعدی است. بنابراین در روز 28 ام پس از آخرین مدیریت Ova محلول، s.c. با به موش ها تزریق شد. موش هایی که به آنها Ova داده شده بود چگالی محلول IgG1 سرم بالاتری را در روزهای 7، 14 و 28 در مقایسه با موش های کنترل و موش هایی که p.o.Ova-NP به آنها داده شده بود نشان دادند. همانطور که پیش بینی می شود، هیچ IgG1 سرم مختص به Ova در موش های کنترل در روزهای 7، 14 یا 28 شناسایی نشد. تزریق s.c. از در روز 28 ، سرم IgG1 را در موش های کنترل تحریک کرد و تا حد زیادی چگالی محلول سرم IgG1 را در موش هایی تقویت کرد که Ova-NP به آنها داده شده بود، اما در موش هایی که محلول Ova به آنها داده شده بود اینطور نبود. در مقایسه با این، موش هایی که Ova-NP به آنها داده شده بود محلول چگالی سرم IgG2c بالاتری را در روز 14 در مقایسه با موش های کنترل و تغذیه شده با Ova نشان دادند. ایمن سازی s.c. تا حد زیادی چگالی محلول سرم IgG2c برای موش های Ova-NP و تغذیه شده با Ova تقویت کرد، درحالیکه موش های کنترل هیچ چگالی محلول سرم IgG2c را قبل یا بعد از ایمن سازی s.c. نشان دادند.
شکل 1 – واکنش های پادتن در سرم موش های تغذیه شده با p.o. و محلول Ova ، Ova-NP یا PBS
شکل 2 – واکنش های IgA روده ای در موش های تغذیه شده با p.o. و محلول Ova ، Ova-NP یا PBS
شکل 3 - شکل 2 –چگالی محلول پادتن های سرم ها در موش های تغذیه شده با p.o.و Ova-NP پس از آماده سازی p.o. یا s.c. با Ova-NP
موش های تغذیه شده با Ova-NPمحلول چگالی سرم IgG2c نسبتاً بالاتری در روز 42 در مقایسه با چگالی محلول موش های کنترل و موش های تغذیه شده با Ova داشتند. برای بررسی تغییرات IgA روده ای مختص به Ova در طول زمان، قرص های مدفوعی از موش های منفرد جمع آوری شدند و از لحاظ وجود IgA مورد بررسی قرار گرفتند. هیچ مقدار قابل اندازه گیری از IgA در عصاره های مدفوعی موش های کنترل و موش های تغذیه شده با Ova-NP در روزهای 7، 14 یا 28 شناسایی نشد. برعکس، موش هایی که با محلول Ova تغذیه شده بودند، چگالی محلول IgA مدفوعی نسبتاً بالاتری را در روز 14 پس از مدیریت p.o. نشان دادند. البته این چگالی های محلول پایدار نبودند و با چگالی های محلول موش های کنترل یا تغذیه شده توسط Ova-NP در روز 28 متفاوت نبودند. ایمن سازی s.c. با در روز 28 تا حد زیادی چگالی های محلول IgA را فقط در عصاره های مدفوعی از موش های ایمن شده با p.o. و Ova-NP تقویت کرد، اما IgA روده ای را در موش های تغذیه شده با Ova خنثی کرد. موش های کنترل تغذیه شده با PBS و ایمن شده با در روز 28 هیچ IgA را در عصاره های مدفوعی در هیچ نقطه زمانی آزمایش شده ای نشان ندادند. موش هایی که با یک دوز از محلول Ova تغذیه شده بودند با مقدار Ova داده شده از طریق Ova-NP قابل مقایسه بودند و سرم IgG1 و IgG2c را نشان دادند که مقداری کمتر از چگالی محلول موش هایی بود که با دوز بالایی از Ova تغذیه شده بودند. در موش هایی که با دوز پایینی از Ova تغذیه شدند، IgA در عصاره های مدفوعی در روز 14 پس از ایمن سازی قابل شناسایی بود و با چگالی محلول IgA در عصاره های موش هایی که با ذوز بالایی از Ova تغذیه شدند قابل مقایسه بود. همچنین، تزریق s.c. با ، IgA روده ای موش هایی را تقویت نکرد که با دوز پایینی از Ova تغذیه شده بودند. موش هایی که با p.o. و Ova-NP تغذیه شده بودند، IgA خیلی بالاتری در مقایسه با موش های تغذیه شده با دوز بالا و پایینی از IgA پس از ایمن سازی s.c. داشتند.
آماده سازی p.o. با Ova-NP برای تحریک تغییر ایزوتایپ ضروری است، که منجر به واکنش ایمنی بدنی IgG2c/IgG1 قطبیده و IgA روده ای می گردد
ما سپس بررسی کردیم که آیا تغذیه با Ova-NP برای قطبش سازی Th1/Th2 و برای تحریک IgA روده ای کاملاً مورد نیاز است. برای اینکار، ابتدا دو گروه از موش ها با p.o. یا s.c. همراه با Ova-NP ایمن سازی شدند و سپس p.o. با Ova-NP تقویت شد. در روز 7 موش های تغذیه شده با s.c. چگالی محلول سرم IgG1 خیلی بالاتری در مقایسه با موش های تغذیه شده با p.o. داشتند، که البته هر دو گروه دارای چگالی محلول سرم IgG1 قابل مقایسه ای در روزهای 14، و 28 پس از ایمن سازی بودند، که تا حدودی توسط ایمن سازی دوم p.o. فقط در موش های تغذیه شده با p.o. افزایش یافت . موش های تغذیه شده با p.o. و Ova-NP چگالی محلول سرم IgG2c قابل توجهی را در روز 14 نشان دادند، که در مقایسه با چگالی های محلول موش های تغذیه شده با s.c. در روزهای 14، 28 و 42 خیلی بالاتر بودند. مانند سری آزمایشات اول، مقدار مهمی از IgA در عصاره های مدفوعی موش های تغذیه شده با p.o. فقط پس از مدیریت Ova-NP با p.o. دوم در روز 28 مشاهده شد. در روز 42 موش های تغذیه شده با p.o. و تقویت شده با p.o. ، IgA نسبتاً بالاتری در مقایسه با موش های تغذیه شده با s.c. و تقویت شده با p.o. و Ova-NP داشتند . بصورت غیر مترقبه ای در روزهای 7 و 42، موش هایی که با s.c. و Ova-NP تغذیه شده بودند IgA قابل اندازه گیری در نمونه های ترکیبی از عصاره های مدفوعی داشتند. تحلیل نمونه های عصاره مدفوعی و سرم فردی جمع آوری شده در روزهای 7 و 42 مشخص ساخت که فقط 1 موش از 5 موش تغذیه شده با s.c. و تقویت شده با p.o. ، سرم IgG2c و IgA روده ای را داشت که میانگین های کلی گروه را تحریف می کرد. آزمایش نسبت های سرم IgG1:IgG2c در روز 42 مشخص ساخت که موش های تغذیه شده با s.c. و Ova+CFA یا Ova-NP باعث واکنش IgG1-غالب شدند، و نسبت های IgG1:IgG2c در مقایسه با نسبت های IgG1:IgG2c موش های تغذیه شده با p.o. و Ova-NP نسبتاً بالاتر بودند. همچنین، موش های تغذیه شده با Ova-NP سپس تقویت شده با s.c. و Ova+CFA یا p.o. با Ova-NP پایین ترین نسبت های IgG1:IgG2c را داشتند که نشاندهنده قطبش Th1 قوی بود. در روز 42 نسبت های IgG1:IgG2c بین این دو گروه تا حد زیادی با هم تفاوت نداشتند.
فرمت این مقاله به صورت Word و با قابلیت ویرایش میباشد
تعداد صفحات این مقاله 12 صفحه
پس از پرداخت ، میتوانید مقاله را به صورت انلاین دانلود کنید
دانلود با لینک مستقیم
دانلود مقاله ایمن سازی دهانی با ذرات نانو پادگن-جفتی 
